1.  引言

環(huán)孢素A (Cyclosporine A, CyA)是一種由11個氨基酸組成的親脂性環(huán)狀多肽，在臨床上被用作一種有效的免疫抑制劑，用于預防各種organ 移植中的同種異體移植排斥反應，以及治療全身和局部自身免疫性疾病。盡管 CyA 具有巨大的治療價值，但其最初的油基口服制劑(Sandimmune®)由于分子量高、剛性環(huán)結構和水溶性差，表現(xiàn)出較高的個體變異性和較差的生物利用度。

p-糖蛋白介導排出腸細胞、廣泛全身代謝前腸壁和肝臟，進一步降低了CyA的口服生物利用度。目前臨床上可用的 CyA 商業(yè)產(chǎn)品是以微乳為基礎的預濃縮制劑(Sandiummune Neole®)，該制劑顯示出相對較高的治療口服生物利用度，且變異性較小。

盡管 Neoral 取得了成功，但 CyA 在口服給藥領域一直受到關注，主要是因為其水溶性極差，滲透性差，而這正式測試口服給藥系統(tǒng)效率具挑戰(zhàn)性的模型藥物之一。在過去的十年中，人們研究了各種納米級藥物遞送系統(tǒng)來提高 CyA 的口服生物利用度。在這些載體中，脂質體因其促進吸收的能力和良好的生物相容性而具有廣闊的應用前景。由磷脂酰膽堿（SPC）和膽固醇 (CHOL) 組成的傳統(tǒng)脂質體制劑的口服生物利用度與 Sandimmune Neoral 相似。

在 Guan 等人之前的研究中，含有膽鹽脫氧膽酸鈉（SDC）的脂質體被證實可以將難溶藥物非諾貝特的口服生物利用度提高5.13倍，此次制備了含有膽鹽脫氧膽酸鈉的CyA脂質體，并在體外和體內(nèi)進行了評價，目的是提高CyA的口服生物利用度。

2.  SPC/SDC脂質體制備

取圓底燒瓶，將SPC、SDC和CyA溶解于二氯甲烷/乙醇（9/1, V/V）溶液中，通過旋轉蒸發(fā)儀在30℃水浴去除有機溶劑。干燥的脂膜在真空中保持2小時，以去除微量的溶劑。然后在40℃下通過磷酸緩沖溶液（50 mM, pH7.4）進行復溶30分鐘，得到脂質體粗分散體。 

然后進行高壓均質，得到粒徑更小的脂質體。脂質體在4℃下保存至使用。對于SPC/Chol脂質體的制備，其步驟類似，使用Chol 替換SDC。

在不同均質參數(shù)、配方變量（SPC/SDC 的比例、SPC 的濃度和 CyA 負載量）下制備了不同脂質體并進行了相應的實驗：

① 使用不同的均質壓力（50,100,150,200bar），不同的均質次數(shù)（5,10,15,20,25次）制備脂質體，測量不同均質參數(shù)下 CyA 脂質體的顆粒大小。

② 使用不同的SPC/SDC 的比例（3/1、4/1、5/1、6/1、9/1）、不同的SPC 的濃度（1%、2%、3%、4%、5%、6%）和 不同的 CyA 負載量（0.8、1.2、1.6、2、2.4 mg/mL）制備脂質體，測量不同濃度配比下 CyA 脂質體的顆粒大小。

4.  結果-均質參數(shù)對粒徑的影響

我們研究了幾個因素對脂質體顆粒大小和分布的影響。如圖 1A 和圖 1C 所示， SPC/SDC 脂質體在均質前通常為 1 μm大小，并表現(xiàn)出較寬的尺寸分布。均質后脂質體的粒徑和多分散性指數(shù)(PI)顯著減小，當均質壓力增加到 100bar 時，脂質體的直徑最小(約80 nm)(圖1B，1C)。

圖1均質參數(shù)對環(huán)磷酰胺SPC/SDC脂質體粒徑和 PI（多分散系數(shù)）的影響?？s寫：Chol，膽固醇；CyA，環(huán)孢素A；PI，多分散指數(shù)；SPC，大豆磷脂酰膽堿；SDC，脫氧膽酸鈉。

(A)和(B)顯示了均質前后載 CyA 的SPC/SDC脂質體的尺寸分布。粒徑和 PI 與不同因素，包括均質壓力（P＜0.01 比較 100 和 150 bar 的 PI；P＜0.001 比較 100 和 150 bar 的 PI）（C）和均質次數(shù)（D）顯示。數(shù)據(jù)以平均值±標準差(n=3)表示。

然而，當均質壓力進一步增加到 200bar 時，顆粒尺寸和 PI（多分散系數(shù)）顯著增加(P<0.01)。這一現(xiàn)象可以用均質大剪切力作用下囊泡的破裂和聚集來解釋。此外，在 100bar 的均質壓力下均質次數(shù)大于 5 次，顆粒大小沒有明顯變化(P＞0.05)(圖1D)。然而，當均質次數(shù)增加到 20 次時，PI （多分散系數(shù)）低，25次均質后可能發(fā)生破裂和聚集，導致 PI 增加(圖1D)。因此，我們選擇了100bar或200bar的均質壓力來制備 SPC/SDC 脂質體，用于后續(xù)的研究。 

為了獲得與 SPC/SDC 脂質體相近的平均粒徑，選擇 300bar 均質20次來均質 SPC/Chol 脂質體，但其柔韌性較差。此外，微米級的脂質體常為多層結構，通常通過薄膜分散法制備而得。進一步的均質可能會產(chǎn)生單層脂質體。 

5.  結果-配方變量對粒徑的影響

SPC/SDC 的比例、SPC 的濃度和 CyA 負載量也對粒徑和分布有顯著影響。在 SPC/SDC 比率為 3/1 時，粒徑約為80 nm, PI為0.1。SPC/SDC比率從3/1增加到4/1（P＞0.05，圖2A）時，雙層結構的粒徑?jīng)]有顯著變化。相反的是，繼續(xù)增加SPC/SDC含量至6/1或9/1，粒徑和PI值顯著增加（圖2A）。

圖2 配方變量對CyA-SPC/SDC脂質體粒徑和 PI（多分散系數(shù)）的影響。縮寫：CHOL，膽固醇；CyA，環(huán)孢素A；PI，多分散指數(shù)；SPC，大豆磷脂酰膽堿；SDC，脫氧膽酸鈉。SPC/SDC(A)的比例(***P＜0.001，比較兩組的顆粒大??；***P＜0.001，以3/1和4/1的比例比較PI)；SPC(B)的濃度(**P＜0.01，比較兩組的顆粒大?。籔＜0.05，比較兩組的PI)；CyA載量(C)(**P＜0.01，比較兩組的顆粒大??；P＜0.001比較兩組的PI)。數(shù)據(jù)以平均值±標準差(n=3)表示。 

脂質雙分子層的粒徑和 PI 值隨著 SDC 含量的減小而減小可能是由于囊泡的柔韌性增加和表面張力降低所致。通過 DHA/SDC 二元混合物制備，增加 SDC 含量，會降低得到懸浮液的粒徑。

進一步研究了 SPC 濃度對顆粒大小和PI的影響，結果表明，將 SPC 的重量比提高到 4% (P＞0.05)，對顆粒大小和 PI 沒有顯著影響。)(圖2B)。然而，當 SPC 的重量比達到 6% 時，脂質體略有增大，PI 增加，這可能是由于 SPC 濃度升高導致粘度增加(圖2B)。

當 CyA 濃度低于 2 mg/mL時，載藥量對顆粒大小和PI無顯著影響(P＞0.05)。然而，當 CyA 負載為 2.4 mg/mL時，顆粒大小和 PI 顯著增加(圖2C)。可能是未包封藥物的再結晶和表面張力的顯著增加。

6.  TEM結果

圖 3 顯示了裝載 CyA 的 SPC/SDC 脂質體的 TEM 照片。載有 CyA 的 SPC/SDC 脂質體的粒徑約為 90 nm，這與通過粒徑測量獲得的結果具有良好的相關性。

圖 3 載有 CyA 的 SPC/SDC 脂質體的 TEM 形態(tài)。縮寫：CyA，環(huán)孢素A；SPC，大豆磷脂酰膽堿；SDC，脫氧膽酸鈉。

7.  結論

在研發(fā)脂質體遞送提高藥物生物利用率過程中，Nicomp 3000 能穩(wěn)定且快速對脂質體顆粒大小、顆粒分布、Zeta電位進行表征，此外還可搭配PSI微射流均質機、AccuSizer顆粒計數(shù)器、德國LUM穩(wěn)定性分析儀，為脂質體的研發(fā)、生產(chǎn)和質量控制提供整套解決方案。 

參考資料

[1] Peipei Guan,Yi Lu,Jianping Qi,Mengmeng Niu,Ruyue Lian,Fuqiang Hu,Wei Wu,Enhanced oral bioavailability of cyclosporine A by liposomes containing a bile salt